Dvoufázová extrakční metoda s použitím methanolu, methyl terc-butyl etheru (MTBE) a vody zahrnuje dvě fáze: jednu pokrývající polární metabolity („metabolomika“) a různé sloučeniny exposomu, jako jsou léčiva („exposomika“) a druhou zahrnující komplexní lipidy („lipidomika“). Pro necílené analýzy jsou používány validované LC–MS metody.

Jelikož pouze jedna jediná LC–MS analýza nedokáže pokrýt celý metabolom/lipidom/exposom, jsou používány odlišné chromatografické metody (kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi – RPLC a hydrofilní interakční chromatografie – HILIC) a režimy ionizace elektrosprejem pro komplexní charakterizaci daných izolovaných frakcí.

Pro pracovní postup LIMeX je používán hmotnostní spektrometr s vysokým rozlišením Thermo Q Exactive Plus ve spojení s kapalinovým chromatografem (Thermo Vanquish). Hmotnostní spektrometr sbírá pro všechny vzorky MS1 spektra a dále data-dependentní MS/MS spektra. Zatímco pro kvantifikaci se používají výšky chromatografických křivek z MS1, MS/MS spektra slouží pro anotaci sloučenin pomocí spektrálních MS/MS knihoven, nebo pro konfirmaci analytu. Získané přístrojové soubory jsou zpracovány pomocí softwaru MS-DIAL 4, včetně anotace komplexních lipidů, polárních metabolitů a dalších detekovaných sloučenin s využitím vlastních, otevřených i komerčních MS/MS spektrálních knihoven (NIST20, MassBank, MoNA).

Pracovní postup LIMeX pro necílenou a cílenou analýzu komplexních lipidů, polárních metabolitů a sloučenin exposomu.

Pro humánní kohortové studie je obvykle reportováno přes 500 komplexních lipidů, 100 polárních metabolitů a desítky sloučenin exposomu (převážně složky potravin a léčiva) pomocí LIMeX-4D (tj. 4 LC–MS platformy).

Všechny sloučeniny jsou kvantifikovány jako výšky chromatografických píků a uváděny v intenzitách detektoru. Tyto hodnoty slouží jako vstup pro jednorozměrné nebo vícerozměrné statistické metody (např. t-test, míra velikosti účinku – fold change, teplotní mapy – heatmaps, analýza hlavních komponent – PCA, částečná diskriminační analýza nejmenších čtverců – PLS-DA).

Pracovní postup LIMeX používá více než 60 různých vnitřních standardů, které lze použít k odhadu absolutních koncentrací různých metabolitů detekovaných v plazmě/séru a tkáních.

Příprava vzorků pro tyto stopové sloučeniny je náročnější a její součástí je extrakce tuhou fázi (SPE) k odstranění hojně zastoupených sloučenin (např. fosfolipidů).

Pro LC–MS analýzu se používá hmotnostní spektrometr SCIEX QTRAP 5500 provozovaný v režimu MRM ve spojený s kapalinovým chromatografem Dionex/Thermo Ultimate 3000 RSLC.

Teoretické izotopology se počítají pro anotované metabolity v Pythonu a instrumentální soubory se zpracovávají pomocí softwaru MRMPROBS. Výšky píků jsou korigovány podle přirozené abundance prvků a izotopické čistoty traceru pomocí IsoCor softwaru.

Laboratoř je certifikována Národní autoritou (SÚKL) a má platný certifikát SLP pro chemické testy analytické chemie a klinické chemie.

U SLP studií jsou pro vývoj a validaci bioanalytických metod nezbytné následující tři kroky:

K analýze farmaceutických sloučenin se používá hmotnostní spektrometr s vysokým rozlišením Thermo Q Exactive Plus ve spojení s kapalinovým chromatografem Thermo Vanquish.

Formulář zašlete Dr. Tomáši Čajkovi a vzorky doručte na adresu:

• Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i.
• Oddělení metabolomiky, místnost E-216
• Vídeňská 1083, Praha, 14220

Po obdržení vašich vzorků bude vytvořeno číslo projektu, jenž je součástí všech platforem, závěrečného reportu a slouží rovněž pro archivaci dat.

Ing. Jiří Hricko
Výzkumný pracovník
LC–MS, SLP

Mgr. Michaela Paučová
Výzkumný pracovník
LC–MS, SLP

Mgr. Tatyana Kobets, Ph.D.
Výzkumný pracovník
statistika, bioinformatika

Ing. Michaela Nováková
Výzkumný pracovník
statistika, bioinformatika

Bc. Aleksandra Shumilova
Výzkumný pracovník
statistika, bioinformatika

Mgr. Petra Zedníková (mateřská dovolená)
Výzkumný pracovník

1. Janovska et al., Mol Metab 369 (2023) 101683 (doi: 10.1016/j.molmet.2023.101683)
2. Cajka et al., Int J Mol Sci 324 (2023) 1987 (doi: 10.3390/ijms24031987)
3. Castillo et al., Mol Nutr Food Res 366 (2022) 2200204 (doi: 10.1002/mnfr.202200204)
4. Martínez-Ramírez et al., LWT - Food Sci Technol 3173 (2022) 114311 (doi: 10.1016/j.lwt.2022.114311)
5. Paluchova et al., Free Radic Biol Med 3193 (2022) 787 (doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2022.11.015)
6. Benova et al., Mol Metab 365 (2022) 101598 (doi: 10.1016/j.molmet.2022.101598)
7. Brejchova et al., Food Chem 388 (2022) 132983 (doi: 10.1016/j.foodchem.2022.132983)
8. Pruchova et al., Antioxidants 11 (2022) 198 (doi: 10.3390/antiox11020198)
9. Stemberkova-Hubackova et al., Clin Transl Med 12 (2022) e645 (doi: 10.1002/ctm2.645)
10. Jacome-Sosa et al., Commun Biol 4 (2021) 1247 (doi: 10.1038/s42003-021-02765-z)
11. Lopes et al., Cell Rep 37 (2021) 109833 (doi: 10.1016/j.celrep.2021.109833)
12. Spackova et al., Cancers 13 (2021) 1709 (doi: 10.3390/cancers13071709)
13. Danhelovska et al., Int J Mol Sci 22 (2021) 7270 (doi: 10.3390/ijms22147270)
14. Koc et al., Sci Rep 11 (2021) 8171 (doi: 10.1038/s41598-021-87494-3)
15. Sistilli et al., Nutrients 13 (2021) 437 (doi: 10.3390/nu13020437)
16. Brejchova et al., Proc Natl Acad Sci USA 118 (2021) e2020999118 (doi: 10.1073/pnas.2020999118)
17. Janovska et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle 11 (2020) 1614 (doi: 10.1002/jcsm.12631)
18. Bardova et al., Nutrients 12 (2020) 3737 (doi: 10.3390/nu12123737)
19. Tsugawa et al., Nat Biotechnol 38 (2020) 1159–1163 (doi: 10.1038/s41587-020-0531-2)
20. Smolkova et al., Sci Rep 10 (2020) 8677 (doi: 10.1038/s41598-020-65351-z)
21. Paluchova et al., Mol Nutr Food Res 64 (2020) 1901238 (doi: 10.1002/mnfr.201901238)
22. Benlebna et al., J Nutr Biochem 79 (2020) 108361 (doi: 10.1016/j.jnutbio.2020.108361)
23. Paluchova et al., Diabetes 69 (2020) 300–312 (doi: 10.2337/db19-0494) 
24. Brezinova et al., Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids 1865 (2020) 158576 (doi: 10.1016/j.bbalip.2019.158576)
25. Angelisová et al., Biochim Biophys Acta Biomembr 1861 (2019) 130–141 (doi: 10.1016/j.bbamem.2018.08.006)
26. Sládek et al., Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids​ 1864 (2019) 158533 (doi: 10.1016/j.bbalip.2019.158533)